畢業(yè)設(shè)計(jì)開題：米曲霉磷酸果糖激酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

大學(xué)本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))開題報(bào)告
學(xué)院：化工學(xué)院　　　　　　　　　　　　　專業(yè)班級(jí)：08生物工程1班

課題名稱 米曲霉磷酸果糖激酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

1、本課題的的研究目的和意義：
研究目的：
1.本課題通過PCR擴(kuò)增得到磷酸果糖激酶基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中以得到磷酸果糖激酶的陽(yáng)性克隆，為后續(xù)構(gòu)建表達(dá)載體，蛋白活性表達(dá)奠定基礎(chǔ)。
2.對(duì)米曲霉磷酸果糖激酶進(jìn)行酶學(xué)分析，二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，為米曲霉的糖酵解代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。為闡述米曲霉的中心碳代謝流提供依據(jù)。

研究意義：
糖酵解途徑（EMP）是糖代謝的重要生理途徑，其主要作用是在有氧條件下為生物體迅速提供能量，其中磷酸果糖激酶是糖酵解途徑的關(guān)鍵限速酶。米曲霉磷酸果糖激酶基因的克隆及酶學(xué)分析能更闡述米曲霉糖酵解途徑，為米曲霉的相關(guān)代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。
2、 文獻(xiàn)綜述（國(guó)內(nèi)外研究情況及其發(fā)展）：
米曲霉（Aspergillus oryzae ） 是一種好氣性真菌，屬于半知菌亞門、曲霉屬，菌絲一般呈黃綠色
……（新文秘網(wǎng)http://m.120pk.cn省略721字，正式會(huì)員可完整閱讀）……　
C5.7.1.11）是糖酵解EMP途徑中的限速酶，負(fù)責(zé)催化6-磷酸果糖為1，6-二磷酸果糖：ATP + 6-磷酸果糖 → ADP + 1，6-二磷酸果糖，其N 末端為結(jié)合ATP 的結(jié)構(gòu)單元，C 末端為結(jié)合6-磷酸果糖的結(jié)構(gòu)單元和磷酸烯醇式丙酮酸反饋調(diào)節(jié)時(shí)結(jié)合的部分[12]。目前磷酸果糖激酶的研究主要集中在原核生物中，如韓蓓等進(jìn)行了球形芽胞桿菌C3-41磷酸果糖激酶的克隆、表達(dá)及基本生物活性[11]，周傳奇等進(jìn)行了騰沖嗜熱厭氧菌6-磷酸果糖激酶的克隆[12],表達(dá)及其生物活性，周雍進(jìn)進(jìn)行了利迪鏈霉菌初級(jí)代謝關(guān)鍵基因的克隆與功能分析[13]，但是絲狀真菌報(bào)道較少。米曲霉磷酸果糖激酶基因克隆和酶學(xué)分析不僅能為后期進(jìn)行蛋白酶的表達(dá)創(chuàng)造條件，更清楚地闡述米曲霉糖酵解途徑，為米曲霉的相關(guān)代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。
3、 本課題的主要研究?jī)?nèi)容（提綱）和成果形式：
主要的研究?jī)?nèi)容：
本課題通過PCR擴(kuò)增得到磷酸果糖激酶基因的克隆，構(gòu)建pMD19-T重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,利用藍(lán)白斑篩選得到磷酸果糖激酶的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，利用菌液PCR、凝膠電泳和酶切驗(yàn)證克隆產(chǎn)物，并對(duì)克隆的基因進(jìn)行基因測(cè)序，最后通過生物信息學(xué)手段對(duì)該基因編碼的酶進(jìn)行酶學(xué)分析、高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和進(jìn)化分析。

成果形式：
本課題致力于米曲霉磷酸果糖激酶的克隆，主要的成果展示為電泳圖譜展示，其中包含了一些實(shí)驗(yàn)測(cè)的的數(shù)據(jù)以及和國(guó)內(nèi)研究情況的對(duì)比分析，并通過生物信息學(xué)對(duì)該基因編碼的酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和酶學(xué)分析，企圖從糖酵解途徑中關(guān)鍵酶出發(fā)，為闡述米曲霉糖酵解途徑和代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。最終的成果主要以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、電泳圖譜和生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)來組合展示，已提供直接的學(xué)習(xí)、研究材料，以備今后做進(jìn)一步的探究。

4、擬解決的關(guān)鍵問題：
不同基因具有各自的特異性，需要摸索磷酸果糖激酶的克隆條件，獲得PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行有效的連接和轉(zhuǎn)化。

目前課題研究存在的主要困難
由于米曲霉磷酸果糖激酶基因片段較長(zhǎng)（2469bp），體外擴(kuò)增較困難，需要對(duì)其體外擴(kuò)增條件進(jìn)行探究；另外長(zhǎng)片段在連接和轉(zhuǎn)化時(shí)也會(huì)遇到一定的困難。在挑選陽(yáng)性克隆子時(shí)實(shí)驗(yàn)量較大。
5、研究思路、方法和步驟：

研究思路和步驟：
1、通過NCBI和DOGAN等數(shù)據(jù)庫(kù)獲得米曲霉果糖激酶基因序列，設(shè)計(jì)引物并合成，
2、提取米曲霉全基因組利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，提純產(chǎn)物，
3、構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，
4、篩選陽(yáng)性克隆并驗(yàn)證產(chǎn)物。
5、對(duì)克隆后的基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析

主要涉及的研究方法：
1、本課題中，經(jīng)過對(duì)相關(guān)的文獻(xiàn)閱讀和一定的實(shí)驗(yàn)比較，建立了米曲霉已糖激酶克隆的實(shí)際操作體系；
2、本課題中利用primer5.0設(shè)計(jì)PCR引物，利用PCR產(chǎn)物提取和凝膠提取兩種方法提純產(chǎn)物；
3、本課題中利用藍(lán)白斑法篩選陽(yáng)性克隆子，利用菌液PCR和凝膠電泳驗(yàn)證產(chǎn)物；
4、利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)該基因及酶進(jìn)行分析。

6、本課題的進(jìn)度安排：

2012.2.15-2012.3.1： 查找文獻(xiàn)，查找基因序列并設(shè)計(jì)引物
2012.3.2-2012.3.15： 探索PCR條件，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；
2012.3.16-2012.4.15：篩選陽(yáng)性克隆子并驗(yàn)證，及生物信息學(xué)分析；
2012.4.16-2012.4.30：對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證性復(fù)合實(shí)驗(yàn)，以保證實(shí)驗(yàn)的結(jié)論準(zhǔn)確性；
2012.5.1-2012.5.20： 寫論文，準(zhǔn)備答辯；

7、參考文獻(xiàn)：
[1] 趙龍飛,徐亞軍.米曲霉的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造,2006,(3)
[2] 王海娟,蘇玉春,吳銘等.米曲霉木聚糖酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)[J].生物技術(shù)通訊,2010, ……（未完，全文共4006字，當(dāng)前僅顯示2023字，請(qǐng)閱讀下面提示信息。收藏《畢業(yè)設(shè)計(jì)開題：米曲霉磷酸果糖激酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析》）