論文開題：堿性蛋白酶生長菌株的篩選及鑒定及蛋白酶基因的克隆（2）

大學(xué)本科畢業(yè)論文(設(shè)計)開題報告
學(xué)院：　　　化工學(xué)院　　　　　　　　　　專業(yè)班級：　　　08級生物技術(shù)

課題名稱 堿性蛋白酶生長菌株的篩選及鑒定及蛋白酶基因的克隆（2）

1、本課題的的研究目的和意義：
蛋白酶是一類能水解蛋白質(zhì)的酶，已廣泛應(yīng)用于食品、釀造、飼料、醫(yī)藥、紡織、日用化學(xué)等多個領(lǐng)域,在洗滌劑、皮革加工、銀回收、醫(yī)療、食品加工、飼料和化學(xué)工業(yè)以及廢物處理上都有重要作用。蛋白酶是目前世界上產(chǎn)銷量最大的商業(yè)酶，其銷售額占酶制劑總銷售額的近60%。該酶廣泛分布于動物、植物及微生物中。20世紀(jì)90年代以來，隨著發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，微生物已日益成為工業(yè)酶制劑的主要來源，而海洋微生物由于其生存的特殊環(huán)境，分泌的各種酶類往往具有適應(yīng)的pH和溫度范圍廣、活性相對穩(wěn)定等特性,已成為新型生物酶開發(fā)的主要資源。近年來，我國蛋白酶研究取得了較大進(jìn)展，但還存在產(chǎn)酶微生物資源開發(fā)不足，蛋白酶種類單一等問題，因此研究的重點(diǎn)仍在于獲得產(chǎn)蛋白酶活力
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離子對產(chǎn)酶（菌液的酶活）的影響。
5）純化蛋白酶，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測蛋白酶中雜質(zhì)含量的高低。另外，每步純化后，測定酶活，換算成比活來表示蛋白酶的純化效果。
3、本課題的主要研究內(nèi)容（提綱）和成果形式：
1）分別測定6號菌株在不同鹽濃度下的生長曲線、不同pH下的生長曲線、不同溫度下的生長曲線，找出較適合生長的鹽濃度、pH、溫度。
2）根據(jù)較適合生長的鹽濃度、pH、溫度，設(shè)計3因素3水平的正交實驗，確定最佳的發(fā)酵條件。
3）蛋白酶純化及其性質(zhì)研究，后者包括酶活的最適反應(yīng)條件、影響因素及分子量。
成果以論文的形式展現(xiàn)。
4、擬解決的關(guān)鍵問題：
1）繪制6號菌株在不同鹽濃度、不同pH、不同溫度下的生長曲線，找出較適合生長的鹽濃度、pH、溫度，找出穩(wěn)定期的起始時間和持續(xù)時間。
2）通過正交實驗，找出最適合生長的鹽濃度、pH、溫度。
3）純化粗酶提取液，使酶的比活增加。
5、研究思路、方法和步驟：
本研究所用菌株的來源：
中國第四次北極考察于2010年7月10日在B02站位（53.328499°N， 169.960434°E，水深1937 m，水溫8℃，鹽度32.9）采集到了含細(xì)菌的水樣。2011屆做畢業(yè)設(shè)計的本科生對該水樣進(jìn)行了分離篩選，得到了6號菌株等一些產(chǎn)蛋白酶的菌株。本研究所采用的菌株即6號菌株。
分離篩選過程：
1)將樣品稀釋成三個梯度（分別稀釋10、100、1000倍），每梯度做三個平行。
2)取200μl各梯度樣品，分別涂布于酪蛋白篩選固體培養(yǎng)基上，標(biāo)記，用保鮮袋包好，于15℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
結(jié)果10倍稀釋的樣品接種后產(chǎn)生了63株菌株，其中包括6號菌株。這些菌株能在酪蛋白平板上生長，說明可產(chǎn)蛋白酶。
3)用事先滅菌好的牙簽挑取各菌株的單菌落接種于酪蛋白篩選平板相應(yīng)位置上，如：標(biāo)記6號的菌落分別接種于兩種平板上標(biāo)記為6的位置，依次完成所有菌落的接種。
這樣可使各菌株生長的初始量一致，接下來比較蛋白水解圈大小即可比較各菌株產(chǎn)蛋白酶活性的相對高低。
4)置于15℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5)培養(yǎng)50 h后，用尺子測量酪蛋白篩選平板上68株菌的蛋白水解圈大小。
結(jié)果6號菌株是產(chǎn)生蛋白水解圈最大的3株菌株之一。因此，在2012年的畢業(yè)設(shè)計中，我對6號菌株的產(chǎn)酶活性和生長特性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
本研究實驗方案:
1）在Zobell 2216E固體平板上用平板劃線法接種6號菌株。
2）待平板上長出一個個菌落后，挑取單菌落，接種到50mL Zobell 2216E液體培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基即種子培養(yǎng)基。
Zobell 2216E液體培養(yǎng)基的配方是：
每升培養(yǎng)基中，含
蛋白胨5g
酵母膏1g
NaCl 30g
水 1000mL
配Zobell 2216E固體培養(yǎng)基時，則再在每升中加入2%的瓊脂（20g）。
3）待種子培養(yǎng)基中的細(xì)菌生長至一定濃度后，鏡檢，以確定沒有染雜菌。一方面進(jìn)行水制片，在油鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)是否均一；另一方面進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察染色結(jié)果是否與預(yù)期一致。根據(jù)11屆畢業(yè)設(shè)計的結(jié)果，6號菌株應(yīng)為革蘭氏陰性菌。染色結(jié)果應(yīng)為紅色。
4）進(jìn)行不同鹽濃度下生長曲線的測定。
①　取500微升菌液（培養(yǎng)基體積的1%），分別接種到鹽濃度為0%、1%、2%、3%、4%、5%的五個Zobell 2216E液體培養(yǎng)基中。每個培養(yǎng)基體積為50mL。在25度、200rpm下培養(yǎng)。
②　每隔8h取一次樣，測OD600。一直測 ……（未完，全文共5384字，當(dāng)前僅顯示1891字，請閱讀下面提示信息。收藏《論文開題：堿性蛋白酶生長菌株的篩選及鑒定及蛋白酶基因的克�。�2）》）