畢業(yè)論文：新型產柚苷酶菌株Phyllobacterium sp.Wb51b的篩選及其鑒定

題目：新型產柚苷酶菌株Phyllobacterium sp.Wb51b的篩選及其鑒定

院（系） 化 工 學 院 ＿
專 業(yè) 生 物 技 術

新型產柚苷酶菌株Phyllobacterium sp.Wb51b的
篩選及其鑒定
摘要
柑橘類水果果汁的深加工過程中會產生嚴重的苦味，使用柚苷酶進行酶法脫苦可以收到良好的效果。此外柚苷酶在其他食品、醫(yī)藥等眾多領域內有著廣泛的應用，其經濟效益越來越得到重視。柚苷酶來源十分廣泛，但目前國內外的研究主要集中于真菌和酵母菌上，對產柚苷酶細菌的研究較少。本研究通過對土壤中細菌的富集培養(yǎng)篩選出一株柚苷酶高產菌Wb51b。從形態(tài)學特征、生理生化特性和16S rDNA等方面對菌株Wb51b進行鑒定，分析結果表明菌株Wb51b為葉桿菌屬(Phyllobacterium)。根據形態(tài)學特征鑒定結果表明該菌株為革蘭氏陰性，其生理生化特征經由對照鑒定手冊，表明其與模式菌株有區(qū)別。最后，對該菌株的生長情況和柚苷酶的表達進行研究，結果表明其酶的表達情況與菌株的生長情況基本一致，同時在時間為64h左右時達到最大值，分別為58.7U/mL和OD600為0.63。
關鍵詞: 柚苷酶；脫苦；細菌鑒定



Screening and identification of Phyllobacterium sp.Wb51b, a new naringinase producer
Abstract
Citrus fruit juices will give serious bitterness durin
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目錄
摘要 I
Abstract II
目錄 III
1緒論 1
1.1柚苷酶 1
1.2柚皮苷 1
1.3柚苷酶高產菌株的篩選 2
1.3.1產柚苷酶細菌的篩選 2
1.3.2產柚苷酶真菌的篩選 2
1.4柚苷酶的應用 3
1.4.1柚汁加工 3
1.4.2其他應用 3
1.5本論文研究的目的、意義及內容 4
2材料與方法 5
2.1實驗材料 5
2.1.1樣品來源 5
2.1.2主要試劑 5
2.1.3主要儀器和設備 5
2.1.4培養(yǎng)基及溶液 6
2.2實驗方法 7
2.2.1采樣 7
2.2.2富集培養(yǎng) 7
2.2.3初篩 7
2.2.4復篩 7
2.2.5菌種保藏 8
2.3菌種的鑒定 8
2.3.1培養(yǎng)特征 8
2.3.2形態(tài)特征 8
2.3.3系統(tǒng)發(fā)育特征 8
2.4生理生化特征 11
2.5檢測與分析方法 11
3結果與討論 14
3.1菌種的篩選 14
3.2選取目的菌株 14
3.3形態(tài)學特征 15
3.3.1 菌落形態(tài) 15
3.3.2革蘭氏染色 16
3.3.2生理生化特征 16
4 結論與展望 21
參考文獻 22





1 緒論
1.1 柚苷酶
柚苷酶廣泛存在于各種絲狀真菌，在其他各種微生物體、多種動植物體組織中也有發(fā)現(xiàn)。Hall在1938年首次發(fā)現(xiàn)芹菜種子中的柚苷酶[1]。因其水解活性可使柑橘類果汁脫苦，柚苷酶有著廣闊的工業(yè)生產應用前景。
柚苷酶（Naringinase）是一種復合水解酶，包含ɑ-L-鼠李糖苷酶（ɑ-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）和 β-D-葡萄糖苷酶（flavonoid-β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21）這兩種酶的活性。它可以將柚皮苷（Naringin）水解成鼠李糖和普魯寧，并進一步水解得到葡萄糖和柚皮素（Naringenin）。其水解過程如圖1所示。












1.2 柚皮苷
柚皮苷的分子式是C22H32O14，分子量580.53，化學名稱是4,5,7-三羥基黃烷酮-7-鼠李糖葡萄糖苷，主要存在于柚子及柑橘類水果的果皮和種子中，果肉中含量相對較少。它溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸、稀堿溶液和熱水，常溫下在水中的溶解度為0.1%，75℃時可達10%，不溶于石油醚、乙醚、苯和氯仿等非極性溶液[3]。
據報道，柚皮苷具有抗癌、抑菌、抑酶、抗氧化、降血膽固醇、降低毛細血管脆性、改善微循環(huán)、治療非典型性肺炎等生理活性，在醫(yī)藥和食品等領域具有極大的應用價值[4]。
1.3 柚苷酶高產菌株的篩選
1.3.1 產柚苷酶細菌的篩選
產柚苷酶的細菌報道比較少見，主要是因為這些產柚苷酶的細菌在工業(yè)上具有很多好處，導致很多學者對細菌產柚苷酶的研究秘密進行 [5]。盡管這樣，最近還是有學者對細菌產柚苷酶進行了文獻報道。Gaston Orillo[6]等從南極海水中分離獲得Pseudoalteromonas和Ralstonia pickettii，在-1-8℃的低溫條件下具有ɑ-L-鼠李糖苷酶活性。Hashimoto[7]等發(fā)現(xiàn)以蘭膠為碳源的S. paucimobilis和Bacillus sp. GL1具有很高的ɑ-L-鼠李糖苷酶活性。Beekwilder[8]和Avila[9]等在乳桿菌屬中發(fā)現(xiàn)具有ɑ-L-鼠李糖苷酶活性。Puri和Kaur[10]等分離獲得一株具有α-L-鼠李糖苷酶活性的Staphylococcus *ylosus。該菌株經優(yōu)化后，柚苷酶的產量到達8.45U/mL[11]。用5L發(fā)酵罐優(yōu)化后，在糖濃度15g/L時其產量達到8.91U/mL[12]。
1.3.2 產柚苷酶真菌的篩選
產柚苷酶的真菌研究是一個相對成熟的方面，目前商業(yè)化的柚苷酶也是來自于真菌，如來自于美國的Sigma公司就有商品柚苷酶，該商品酶產自青霉。
Puri和Kalra[13]利用黑曲霉MTCC1344獲得胞外柚苷酶，其中糖蜜和蛋白胨是最佳的碳源和氮源，培養(yǎng)基中加入金屬離子可以提高酶的產率。Busto等[14]從黑曲霉CECT2088中誘導獲得柚苷酶。同年，Birgisson等[15]從E.coli中獲得ɑ-L-鼠李糖苷酶并設計出一個反應器用于柚皮苷的水解。為了獲得新的柚苷酶來源，Thammawat等[16]于2008年在中國臺灣分離獲得348株真菌，研究表明柚苷酶的最適溫度和最適pH值分別為40℃和4.0。其中黑曲霉BCC25166被用于進一步的研究，結果顯示在對發(fā)酵過程優(yōu)化獲得酶活最高的條件是3.75g/L鼠李糖為碳源和2.5g/L硝酸鈉為氮源。Chang等[17]分離獲得醬油曲霉具有很高的柚苷酶活性,研究表明該醬油曲霉產的柚苷酶能夠對食品方面的脫苦有很好的效果。
李利君等[18]獲得一株產柚苷酶的酵母菌--羅倫隱球酵母Jmedeb008，其中該酵母的柚苷酶產酶受到葡萄糖效應的影響。
1.4 柚苷酶的應用
1.4.1 柚汁加工
柚子為雙子葉植物綱無患子目蕓香科柑橘屬植物，喬木。果實呈圓球形、扁圓形、梨形或闊圓錐形，橫徑通常10厘米以上，淡黃或黃綠色。柚子含有豐富的蛋白質、有機酸、維生素以及鈣、磷、鎂、鈉等人體必需的元素，每100g可食用部分含水88.4g、蛋白質0.7g、脂肪0.6g、糖10.2g、鈣41mg、磷43mg、鐵0.9mg[19]。柚子對高血糖、高血壓、高血脂、糖尿病、血管硬化等疾病有較好的輔助治療作用。
我國有著豐富的柑橘資源，但柑橘加工過程的瓶頸在于產生的苦味難以消除，其苦味物質是檸檬苦素和柚皮苷，而柚皮苷是主要苦味物質。工業(yè)上一般采用中性多聚吸附劑或微酸吸附樹脂進行吸附脫苦，但成本較高且會破壞果汁原有的營養(yǎng)成分。采用柚苷酶水解柚皮苷不僅可使苦味降低90%以上，而且作用專一，不會對果汁風味和營養(yǎng)成分有任何影響[20]。汪釗 ……（未完，全文共17854字，當前僅顯示3211字，請閱讀下面提示信息。收藏《畢業(yè)論文：新型產柚苷酶菌株Phyllobacterium sp.Wb51b的篩選及其鑒定》）