堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株vv8酶學(xué)性質(zhì)研究（開題報告）

大學(xué)本科畢業(yè)論文(設(shè)計)開題報告
學(xué)院：化工學(xué)院　　　　　　　　 專業(yè)班級：2009級生物工程（2）班

課題名稱 堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株vv8酶學(xué)性質(zhì)研究

1、本課題的的研究目的和意義：
1.1研究目的：新型蛋白酶8的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)分析
1.2研究意義：在實驗室條件下培養(yǎng)產(chǎn)低溫蛋白酶菌株VV8后收集粗酶液，然后運用離心、冷凍干燥、DEAE-52 柱層析、Sephade* G-75 凝膠過濾等技術(shù)將堿性蛋白酶進(jìn)行提純，得到純酶后進(jìn)行蛋白酶特性研究。對酶的特性研究包括以下方面：最適酶活的pH、溫度的測定，抑制因子對酶活影響測定。最后再將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析匯總。為之后堿性蛋白酶的生產(chǎn)應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

2、 文獻(xiàn)綜述（國內(nèi)外研究情況及其發(fā)展）：
蛋白酶( Protease)是水解蛋白質(zhì)的一大類酶的通稱，廣泛應(yīng)用于食品、洗滌添加劑、飼料、造紙、制藥等行業(yè)，占世界用酶市場60%以上的份額。低溫蛋白酶是一個相對概念，其最適作用溫度通常比同功能的中溫(50℃)蛋白酶要低 20－30℃左右，且在較低的溫度下(0－20℃)擁有較高的酶活性，而在高溫條件下(＞ 60℃)的酶活性較差。正是由于這些特點使得低溫蛋白酶在食品加工業(yè)、冷水洗滌劑、動植物抗凍醫(yī)用疫苗以及生物保鮮方面有著普通
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目前,我國堿性蛋白酶研究已經(jīng)達(dá)到了分子水平,利用基因工程手段和蛋白質(zhì)工程手段定向改造以提高堿性蛋白酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶活力及酶學(xué)性質(zhì)是今后很長時間的一個發(fā)展趨勢。隨著基因工程技術(shù)研究的深人和應(yīng)用技術(shù)手段的完善,堿性蛋白酶研究將會進(jìn)人一個全新的階段。
3、 本課題的主要研究內(nèi)容（提綱）和成果形式：
3.1主要研究內(nèi)容：
本課題在實驗室條件下培養(yǎng)產(chǎn)低溫蛋白酶菌株VV8后收集粗酶液，，通過LOWRY法對菌株VV8進(jìn)行蛋白酶活性測定，而后運用離心、冷凍干燥、DEAE-52 柱層析、Sephade* G-75 凝膠過濾等技術(shù)將堿性蛋白酶進(jìn)行提純，并研究該蛋白酶的最佳pH值，最適溫度，酸堿穩(wěn)定性以及熱穩(wěn)定性，以及抑制劑對酶活的影響。
（1）產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)
（2）粗酶的制備；；
（3）低溫蛋白酶的分離純化
（4）低溫蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

3.2成果形式：以數(shù)學(xué)模型和論文的形式提交成果。

4、擬解決的關(guān)鍵問題：

粗酶性質(zhì)的研究；分離純化目標(biāo)蛋白酶；純酶酶學(xué)性質(zhì)研究。

5、研究思路、方法和步驟：
5.1產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)；
菌株的活化培養(yǎng)：將冷凍保存的菌株VV8接種到明膠平板上，待長出菌落后將其接種于20ml 2216E液體培養(yǎng)基中，在250rmin/30℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)3d，作為種子培養(yǎng)液。而后以5%的接種量，100ml培養(yǎng)，30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)3天。
5.2粗酶的制備
粗酶液的制備：將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行離心（10000rpm，10min），取上清，然后進(jìn)行抽濾，取5ml于4℃保存，待用，測初酶活及蛋白含量測定。
5.3低溫蛋白酶的分離純化
（1）發(fā)酵液的冷凍濃縮
將粗酶液分裝在合適的敞口容器中，然后放置于-20℃中冷凍凝固，之后放入冷凍干燥機(jī)中凍干2 d，凍干后取適量樣品用無菌水溶解，于-20℃儲存。剩余凍干樣品粉末進(jìn)行封裝，于4℃保存。
（2）透析袋的預(yù)處理及透析
將透析袋預(yù)處理后，將凍干溶解后的樣品裝入透析袋中，兩端用夾子夾緊密封，放入盆中用自來水透析過夜，期間多次換水；之后再以蒸餾水透析12~15 h。透析完成后取出酶液，瞬時離心去除不溶物，并將酶液放于-20℃保存。
（3）再次冷凍干燥2d；
（4）DEAE-52 柱層析進(jìn)行離子純化
（5）Sephade* G-75 凝膠過濾，進(jìn)行驗證，回收濃縮得純酶。
5.4 蛋白酶的理化性質(zhì)的分析
(1) SDS-PAGE測定蛋白酶分子量及純度
(2) 蛋白活性電泳
（3）酶的最佳溫度測定及熱穩(wěn)定性
（4）酶活最佳pH測定及pH穩(wěn)定性
（5） 抑制因子對酶活的影響測定
5.5酶活及蛋白含量的測定
本實驗采用LOERY法測定酶活力及蛋白含量，蛋白酶可水解酪蛋白，產(chǎn)生的酪蛋白可以和福林試劑反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定的藍(lán)色化合物，在一定濃度范圍內(nèi)，所產(chǎn)生的藍(lán)色化合物顏色深淺與酪蛋白含量之間存在線性關(guān)系，因此可通過酪蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品酶活。
(1)Tyr標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
(2)酶活力測定

6、本課題的進(jìn)度安排：
(1) 2.28-3.5 文獻(xiàn)閱讀，實驗方案確立。
(2) 3.6-4.30 實驗實施階段。
(3) 5.1-5.20 數(shù)據(jù)統(tǒng)計、補(bǔ)充實驗及論文寫作和修改。
7、參考文獻(xiàn)：
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[7] C. R. Tremacoldi ,R. Mont ……（未完，全文共4915字，當(dāng)前僅顯示2482字，請閱讀下面提示信息。收藏《堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株vv8酶學(xué)性質(zhì)研究（開題報告）》）