堿性蛋白酶生產菌株vv8酶學性質研究（開題報告）

大學本科畢業(yè)論文(設計)開題報告
學院：化工學院　　　　　　　　 專業(yè)班級：2009級生物工程（2）班

課題名稱 堿性蛋白酶生產菌株vv8酶學性質研究

1、本課題的的研究目的和意義：
1.1研究目的：新型蛋白酶8的分離純化及酶學性質分析
1.2研究意義：在實驗室條件下培養(yǎng)產低溫蛋白酶菌株VV8后收集粗酶液，然后運用離心、冷凍干燥、DEAE-52 柱層析、Sephade* G-75 凝膠過濾等技術將堿性蛋白酶進行提純，得到純酶后進行蛋白酶特性研究。對酶的特性研究包括以下方面：最適酶活的pH、溫度的測定，抑制因子對酶活影響測定。最后再將所得數據進行分析匯總。為之后堿性蛋白酶的生產應用奠定研究基礎。

2、 文獻綜述（國內外研究情況及其發(fā)展）：
蛋白酶( Protease)是水解蛋白質的一大類酶的通稱，廣泛應用于食品、洗滌添加劑、飼料、造紙、制藥等行業(yè)，占世界用酶市場60%以上的份額。低溫蛋白酶是一個相對概念，其最適作用溫度通常比同功能的中溫(50℃)蛋白酶要低 20－30℃左右，且在較低的溫度下(0－20℃)擁有較高的酶活性，而在高溫條件下(＞ 60℃)的酶活性較差。正是由于這些特點使得低溫蛋白酶在食品加工業(yè)、冷水洗滌劑、動植物抗凍醫(yī)用疫苗以及生物保鮮方面有著普通
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目前,我國堿性蛋白酶研究已經達到了分子水平,利用基因工程手段和蛋白質工程手段定向改造以提高堿性蛋白酶產生菌產酶活力及酶學性質是今后很長時間的一個發(fā)展趨勢。隨著基因工程技術研究的深人和應用技術手段的完善,堿性蛋白酶研究將會進人一個全新的階段。
3、 本課題的主要研究內容（提綱）和成果形式：
3.1主要研究內容：
本課題在實驗室條件下培養(yǎng)產低溫蛋白酶菌株VV8后收集粗酶液，，通過LOWRY法對菌株VV8進行蛋白酶活性測定，而后運用離心、冷凍干燥、DEAE-52 柱層析、Sephade* G-75 凝膠過濾等技術將堿性蛋白酶進行提純，并研究該蛋白酶的最佳pH值，最適溫度，酸堿穩(wěn)定性以及熱穩(wěn)定性，以及抑制劑對酶活的影響。
（1）產酶菌株的培養(yǎng)
（2）粗酶的制備；；
（3）低溫蛋白酶的分離純化
（4）低溫蛋白酶的酶學性質研究

3.2成果形式：以數學模型和論文的形式提交成果。

4、擬解決的關鍵問題：

粗酶性質的研究；分離純化目標蛋白酶；純酶酶學性質研究。

5、研究思路、方法和步驟：
5.1產酶菌株的培養(yǎng)；
菌株的活化培養(yǎng)：將冷凍保存的菌株VV8接種到明膠平板上，待長出菌落后將其接種于20ml 2216E液體培養(yǎng)基中，在250rmin/30℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)3d，作為種子培養(yǎng)液。而后以5%的接種量，100ml培養(yǎng)，30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)3天。
5.2粗酶的制備
粗酶液的制備：將培養(yǎng)好的菌液進行離心（10000rpm，10min），取上清，然后進行抽濾，取5ml于4℃保存，待用，測初酶活及蛋白含量測定。
5.3低溫蛋白酶的分離純化
（1）發(fā)酵液的冷凍濃縮
將粗酶液分裝在合適的敞口容器中，然后放置于-20℃中冷凍凝固，之后放入冷凍干燥機中凍干2 d，凍干后取適量樣品用無菌水溶解，于-20℃儲存。剩余凍干樣品粉末進行封裝，于4℃保存。
（2）透析袋的預處理及透析
將透析袋預處理后，將凍干溶解后的樣品裝入透析袋中，兩端用夾子夾緊密封，放入盆中用自來水透析過夜，期間多次換水；之后再以蒸餾水透析12~15 h。透析完成后取出酶液，瞬時離心去除不溶物，并將酶液放于-20℃保存。
（3）再次冷凍干燥2d；
（4）DEAE-52 柱層析進行離子純化
（5）Sephade* G-75 凝膠過濾，進行驗證，回收濃縮得純酶。
5.4 蛋白酶的理化性質的分析
(1) SDS-PAGE測定蛋白酶分子量及純度
(2) 蛋白活性電泳
（3）酶的最佳溫度測定及熱穩(wěn)定性
（4）酶活最佳pH測定及pH穩(wěn)定性
（5） 抑制因子對酶活的影響測定
5.5酶活及蛋白含量的測定
本實驗采用LOERY法測定酶活力及蛋白含量，蛋白酶可水解酪蛋白，產生的酪蛋白可以和福林試劑反應產生穩(wěn)定的藍色化合物，在一定濃度范圍內，所產生的藍色化合物顏色深淺與酪蛋白含量之間存在線性關系，因此可通過酪蛋白含量標準曲線算出樣品酶活。
(1)Tyr標準曲線的制作
(2)酶活力測定

6、本課題的進度安排：
(1) 2.28-3.5 文獻閱讀，實驗方案確立。
(2) 3.6-4.30 實驗實施階段。
(3) 5.1-5.20 數據統(tǒng)計、補充實驗及論文寫作和修改。
7、參考文獻：
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[6] 顧燕玲,徐宇麗,史學偉,鄭曉吉,周紅,倪永清. 天山1號冰川底部沉積層產β-半乳糖苷酶低溫菌株的的篩選及其系統(tǒng)發(fā)育[J]. 微生物學報,2013,53,(2):164-172
[7] C. R. Tremacoldi ,R. Mont ……（未完，全文共4915字，當前僅顯示2482字，請閱讀下面提示信息。收藏《堿性蛋白酶生產菌株vv8酶學性質研究（開題報告）》）